Авторы: Руководитель отделения для недоношенных детей, Заслуженный деятель науки России Академик РАЕН, доктор медицинских наук. Профессор Яцык Г.В.; Руководитель лаборатории цитохимии, доктор биологических наук Петричук С.В.
В последние годы у большинства новорожденных детей отмечаются стойкие нарушения функций различных органов и систем, развивается синдром дизадаптации (синдром повышенной возбудимости, дизбактериоз, дискенезия желудочно-кишечного тракта, аллергические реакции, затяжное и рецидивирующее течение ОРВИ)
В отделении новорожденных и недоношенных детей проводились исследования по применению ректальных суппозиториев «Корилип», содержащих кофакторы и субстраты различных метаболических циклов.
Применение суппозиториев в детской практике в значительной степени определяется необходимостью ограничения внутривенных и внутримышечных инъекций, особенно у новорожденных и грудных детей.
Суппозиторий «Корилип» содержит:
Все продукты питания в организме расщепляются до ацетил-КоА (аминокислоты — до кетоглутарата, сукцината, фумарата и оксалоацетата), который вступает в конечный путь окисления — в цикл трикарбоновых кислот. Оптимизировать деятельность ферментных систем цикла Кребса можно разными путями, в частности, введением субстратов или кофакторов.
Активация цикла ди- и трикарбоновых кислот возможна также \путем регуляции двух важных этапов: 1) окисления пировиноградной кислоты до ацетил-КоА и затем взаимодействия с оксалоацетатом до образования лимонной кислоты; 2) окисления кетоглутаровой кислоты до сукцината (янтарной кислоты). Оба эти этапа катализируются полиферментными комплексами в состав/ которых входитлипоевая кислота.
Кокарбоксилаза является коферментом ферментов, «1участвующих в процессах углеводного обмена, катализирует, карбоксилирование и декарбоксилирование а-кетокислот. Рибофлавинмононуклеотид (ФМН) представляет собой готовую форму кофермента, образующуюся в организме из рибофлавина(В2) путем фосфорилирования. ФМН является предшественником одного из основных переносчиков электронов — флавинадениннуклеотида. ФМН входит в состав активного центра флавиндегидрогеназ, в частности сукцината и а-глицерофосфата.
Комплекс «Корилип» показан в случаях понижения активности флавопротеидов (в более выраженной форме — это проявление хронической тканевой гипоксии), деформации клеточного распределения в сторону преобладания клеток с низкой активностью, низким клеточным разнообразием и пр.
Состав суппозиториев разработан совместными усилиями сотрудниками лаборатории цитохимии под руководством профессора Нарциссова Р.П. и сотрудниками НИИ фармации под руководством канд. фарм. наук Г.С.Киселёвой и Л.В. Сологуб. Состав суппозиториев был определён на основании изменений ферментативной активности в клетках периферической крови и внутренних органов.
Основная задача данного исследования — оценка эффективности применения суппозиториев «Корилип» у доношенных и недоношенных новорожденных была решена с использованием ряда функциональных, биохимических, цитохимических и математико-статистических методов исследования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
На первой неделе жизни 134 недоношенных новорожденных с гестационным возрастом в среднем 33,4 ± 2,15 недель. Вес недоношенных новорожденных при рождении был 1806 ± 578 грамм, длина 43+ 3 см. У 81 новорожденного наблюдался синдром дыхательных расстройств (СДР), который был обусловлен частичным ателектазом легких, остальные недоношенные новорожденные не имели признаков СДР и составили группу условно здоровых недоношенных новорожденных. Всех новорожденных с СДР, в зависимости от выраженности клинико-лабораторных симптомов дыхательной недостаточности, разделили по степени тяжести (1 — 3) согласно классификации К.А.Сотниковой (1986 г.). Каждому новорожденному, на основе компьютеризированных прогностических алгоритмов, разработанных В.М.Шищенко (1988-1991), составили сценарий психомоторного развития и заболеваемости инфекционной патологией в течение первого месяца жизни. Часть новорожденных (74 ребенка) относились к группе высокого риска развития пневмонии (прогностический коэффициент 10-14 баллов). Все больные с СДГ находились в кювезах с постоянной подачей кислорода через аппарат Боброва. Антибиотики внутримышечно вводились 38 новорожденным, перорально — 9; 12 новорожденных с СДР тяжелой степени и высоким прогностическим коэффициентом развития сепсиса одновременно получали 2 антибиотика. Эуфиллин внутривенно вводился 19 новорожденным, перорально — 17. Кроме этого, больные внутривенно получали пироцетам (6 детей), 10 детей получали 15% раствор глюкозы с витамином С, перорально давались холестерамин, панангин (21 ребенок), кавинтон (18 детей), люминал, тавигил. В комплексное обследование больных с СДР, наряду с общепринятыми анализами крови, рентгенографией грудной клетки, КЩС артериализированной капиллярной крови, включили исследование газообменной функции легких (потребления 02 (пО2), выделения СО2 (вСО2), альвеолярной вентиляции (Уа), минутного объема дыхания (МОД).
В работе было обследовано также 82 ребенка, из которых 56 детей были с гипоксическими поражениями центральной нервной системы и 26 детей были здоровыми. Среди обследованных детей было 32 новорожденных ребенка и 50 детей в возрасте от 1 месяца до года. Среди новорожденных 16 детей были здоровыми, 7 детей перенесли острую интранатальную гипоксию, 9 детей перенесли хроническую антенатальную гипоксию. Среди детей грудного возраста 10 детей были здоровыми, 40 детей с гипоксическим поражением ЦНС.
Назначение и контроль за эффективностью суппозиториев «Корилип» осуществлялся с помощью количественного цитохимического анализа.
Ферментный статус лимфоцитов периферической крови исследовали в классическом варианте постановки реакции (Р.П.Нарциссов, 1969-1984), включающем определение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и глицерофосфатдегидрогеназы (ГФДГ), а также в различных модификациях классического варианта, позволяющих оценить проницаемость мембран и устойчивость локуса митохондрий, содержащего
сукцинатдегидрогеназу. Проницаемость мембраны митохондрий опосредованно оценивали по активности СДГ после 10 мин. инкубации. Исходили из того, что скорость образования продукта реакции при выявлении активности СДГ максимальна в первые минуты экспозиции и минимальна при времени экспозиции 60 минут.
Анализ результатов цитохимической реакции.
Готовые мазки микроскопируются под водной иммерсией (увеличение 400 раз) на микроскопе Биолам Р-16. Об активности фермента в клетке судят по количеству темно-фиолетовых гранул формазана, образовавшихся в процессе ферментативного восстановления п-нитротетразолия фиолетового.
Для определения активности фермента в популяции лимфоцитов подсчитывается количество гранул в 30 — 100 клетках, а затем рассчитываются по специальной программе параметры распределения популяции (рис. 1)
Рис. 1. Изображения лимфоцитов при проведении цитохимической реакции на выявление активности СДГ (вид под микроскопом, увеличение 1000).
Методы статистической обработки результатов цитохимических реакций.
При статистической обработке полученных данных основную информацию об активности ферментов в клетках крови получают по изменению средней величины (О), которая дает общую характеристику большого количества клеток, но, однако, не отражает различия, существующего между членами клеточной популяции.
где X — число гранул в каждой (-той клетке, N — число клеток.
В норме средняя активность СДГ изменяется в пределах от 18,5 до 19,5 гранул на лимфоцит, средняя активность ГФДГ — от 11 до 13 гранул на лимфоцит.
Клетки крови значительно различаются по активности выявляемого фермента. Коэффициент вариации (V) характеризует рассеивание вариантов относительно среднего значения, отражает гетерогенность клеток по активности фермента или относительную разнородность клеток.
В норме коэффициент вариации для СДГ и а-ГФДГ лимфоцитов меняется от 27,6 до 29,4%.
При существенном различии клеток по активности фермента -показатель высокий (до 50% и выше). Коэффициент вариации увеличивается в условиях гипоксии, в начальный период иммуногенеза, в острый период ОРВИ и острой пневмонии и др.
Коэффициент асимметрии (А) характеризует распределение членов популяции по уровню активности относительно средней величины или уравновешенности клеточного пула с различной ферментативной активностью. При увеличении количества клеток с высокой активностью в сочетании с единичными низкоактивными клетками — коэффициент асимметрии имеет отрицательный знак (А<0). При обратной ситуации — преобладание пула низкоактивных клеток в сочетании с единичными высокоактивными лимфоцитами -коэффициент асимметрии положителен (А>0).
В состоянии физиологического покоя количество клеток с низкой активностью дегидрогеназ уравновешено количеством клеток с высокой активностью: коэффициент асимметрии для обоих ферментов колеблется в пределах от 0 до 0,5. Значения коэффициента асимметрии, отличные от этого диапазона, характерны для патологических состояний. Например, при хронической гипоксии новорожденных в большинстве лимфоцитов наблюдается депрессия дегидрогеназ, что выражается в отрицательном коэффициенте асимметрии.
Коэффициент эксцесса (Е) характеризует избыток или недостаток субпопуляции клеток с нормальной (близкой к средней) активностью фермента.
Функциональное состояние покоя характеризуется эксцессом, приближенным к нулю: коэффициент эксцесса для обоих ферментов меняется от -0.5 до 0.5.
С клинической точки зрения наименее благоприятной ситуацией является состояние клеточной популяции с отрицательным эксцессом (рис.2).
В стадии ремиссии хронического заболевания или при восстановлении после острого заболевания (ОРВИ, пневмония, инфекционные заболевания и пр.) коэффициент эксцесса становится положительным. При выздоровлении популяция лимфоцитов приближается к нормальному распределению (эксцесс около нуля).(рис.2)
Относительная энтропия информации (Н) характеризует разнообразие клеток по их энзиматической активности.
где 
(j) гранул.
Теоретически, если все клетки популяции имеют одинаковую активность, то энтропия информации равна нулю, если все клетки популяции имеют разную активность — энтропия информации равна 1. Иными словами, клеточное разнообразие (Н) характеризует разброс клеточной популяции по активности фермента, независимо от средней активности.
В норме энтропия информации меняется в пределах от 0,73 до 0,80 для СДГ и от 0,60 до 0,70 для ГФДГ. Клинически неблагоприятным признаком является снижение этого показателя, которое может наблюдаться при низкой, нормальной или высокой активности в клетках.
Таким образом, цитохимический метод исследования позволяет определить 5 статистических параметров, характеризующих активность фермента в клеточной популяции.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Поиск тестовых критериев эффективности терапии начали с оценки интенсивности дыхания (до начала базисной терапии) на разных функциональных уровнях организма до и через 40 минут после введения суппозиториев «Корилип» с комплексом кофакторов и субстратов энергетического обмена. Учитывая то обстоятельство, что для показателей дыхания недоношенных новорожденных характерна большая вариабельность, при описании их изменений использовали сигмальные отклонения средних показателей.
Средняя активность СДГ лимфоцитов через 40 минут после введения суппозиториев изменялась в среднем по группе с 20,35 до 21,5 гр/ЛФ, при этом индивидуальные исходные значения активности СДГ колебались от 12, 3 до 31,5 гр/ЛФ. В связи с этим возникло предположение, что внутри группы больных с СДР существуют несколько подгрупп с разной исходной активностью, что влечет за собой разную реакцию на введение суппозиториев. Этим можно объяснить незначительные изменения активности СДГ при усреднении показателя по всей группе детей.
Группа из 62 детей была разделена на две подгруппы. Первую группу составили 45 детей со сниженной активностью СДГ, перенесшие хроническую тканевую гипоксию с синдромом угнетения ЦНС. Во вторую группу вошли 17 детей с синдромом повышенной нервно-рефлекторной возбудимостью, у которых наблюдалась картина гиперактивации СДГ. Анализ индивидуальных изменений показал, что у новорожденных детей с исходно сниженным уровнем активности дегидрогеназ в ответ на введение комплекса «Корилип» происходит увеличение средней активности сукцината и глицерофосфата, при этом изменения структуры популяции клеток (снижение коэффициентов асимметрии, эксцесса, вариации) свидетельствовали об энергетической стабилизации клеточной популяции, особенно после проведенного 10-дневного курса (табл.1, рис.3).
Таблица 1.
Динамика активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов у недоношенных новорожденных с СДР после введение комплекса «Корилип».
Рис.3. Динамика средней активности сукцинатдегидрогеназы недоношенных новорожденных с СДР при лечении комплексом «Корилип»
Для исследования степени напряжения энергетического метаболизма в ответ на введение комплекса суппозиториев «Корилип» нами использовалась модификация цитохимического анализа — проба с добавлением к основному субстрату модулятора активности СДГ — изолимонной кислоты (проба с изоцитратом, СДГ(ИЗО)) [Петричук СВ. и соав., 1990]. Известно, что в ответ на действие интенсивного внешнего раздражителя происходит резкое повышение выработки энергетических ресурсов в клетках организма, идущих на обеспечение ответной реакции. Для предотвращения чрезмерного расходования субстратов энергетического цикла и истощения митохондриальной активности существует защитный механизм блокирования основного митохондриального фермента — сукцинатдегидрогеназы. Данный блок инактивируется при проведении реакции по выявлению активности СДГ с добавлением изолимонной кислоты к основному субстрату. Повышение активности фермента в пробе с изолимонной кислотой, по сравнению с пробой на основном субстрате свидетельствует о напряжении энергетического метаболизма у недоношенных детей с СДР до введения суппозиториев.
Для оценки степени напряжения энергетического метаболизма вычисляется коэффициент К:
К=СДГ(ИЗО)/СДГ=1,15 или 115%
Значение коэффициента «К»>1 является неблагоприятным цитохимическим признаком, свидетельствует о напряжении клеточного метаболизма и о нестабильности митохондриальной мембраны. У условно здоровых новорожденных значение коэффициента «К» составляет 80 — 90 %. В процессе лечения суппозиториями «Корилип» значение коэффициента «К» уменьшается и приближается к нормальным значениям (рис.3)
У всех новорожденных детей с СДР наблюдается резкое снижение (на 60%) активности митохондриальной глицерофосфатдегидрогеназы — флавопротеида, отражающего работу глицерофосфатного челночного механизма по транспорту электрон-эквивалентов из цитоплазы в митохондрии и интенсивность обмена фосфолипидов. Через 40 минут после приема комплекса «Корилип» наблюдается тенденция к активации глицерофосфатдегидроназы. В конце 10-дневного курса лечения происходит достоверное увеличение средней активности и сдвиг параметров распределения лимфоцитов в сторону нормализации (таблица 2).
Рис. 4. Динамика коэффициента напряжения энергетического метаболизма («пробы с изоцитратом») у детей первой группы в процессе лечения.
Изменения внутриклеточного метаболизма в ответ на введение комплекса «Корилип» побудили выяснить как оптимизация дыхания на клеточном/субклеточном уровне влияет на интенсивность и эффективность дыхания на более высоких функциональных уровнях организации.
Таблица 2. Динамика активности глицерофосфатдегидрогеназы лимфоцитов у недоношенных новорожденных с СДР после введение комплекса «Корилип» (п=62).
У 51 недоношенного новорожденного с СДР различной степени тяжести исследовали показатели КЩС и напряжения газов артериализированной капиллярной крови до и через 40 минут после введения комплекса препаратов (табл.3). Полученные данные свидетельствовали о том, что кофакторы цикла Кребса в первую очередь активизировали выделение СО2 из организма через легкие и почки. Так, рСО2 с 39,04 снижалось до 34,6 мм рт.ст. (РО.05), а в подгруппе глубоко недоношенных новорожденных это снижение было еще более значительным. После приема комплекса «Корилип» у детей улучшились также показатели содержания кислорода в крови.
Таблица 3. Изменение показателей кислотно-щелочного состояния артериализированной капиллярной крови у недоношенных новорожденных с СДР через 40 минут после введения комплекса «Корилипа» (М ±т)
В подгруппе глубоко недоношенных новорожденных через 40 минут после введения комплекса «Корилипа» обнаружено смещение рН в щелочную сторону с 7,341 до 7,393 (РО.05), а также уменьшение дефицита оснований (ВЕ) с -4,46 до -2,57 (Р<0.05). В большей степени сдвиг КЩС в сторону физиологической нормы, по-видимому, был обусловлен нормализацией внутриклеточного метаболизма. Нельзя исключить и прямого ощелачивающего воздействия «Корилипа». Так, А.Г.Антонов (1980) описал выраженный внутриэритроцитарный ощелачивающий эффект кокарбоксилазы у недоношенных новорожденных с перинатальной энцефалопатией.
Воздействие одноразовой дозы «Корилипа» на органный уровень дыхания оценили по динамике газообменной функции легких (табл.4).
Таблица 4. Изменение газообменной функции у недоношенных новорожденных с СДР через 40 минут после введения комплекса «Корилип».
Через 40 минут после введения комплекса препаратов отмечено увеличение альвеолярной вентиляции (Уа). Наиболее выраженным это увеличение было в подгруппе глубоко недоношенных новорожденных: с 119.9 до 152.55 мл/мин (на 27.2%, Р<0.05).
Выделение СО2 (вСО2) легкими увеличивалось более значительно, чем поглощение 02 (пО2), на что указывало и повышение дыхательного коэффициента (ДК). В подгруппе глубоко недоношенных новорожденных вСО2 увеличивалось с 6,38 до 7,61 (на 19.3%, Р<0.05). При этом механическая функция легких, которую лучше всего отражает минутный объем дыхания (МОД), не изменялась. Это указывало на то, что повышение альвеолярной вентиляции (\/а) происходило не за счет увеличения объема легочной вентиляции, а за счет повышения эффективности внешнего дыхания, что подтверждало и значительное снижение ОЕ в подгруппе глубоко недоношенных новорожденных.
Индивидуальная чувствительность больного организма к «Корилипу» побудила оценить диагностическую ценность индукции дыхания в рамках околочасового биоритма.
Для этого провели пошаговый регрессионный анализ изучаемых показателей дыхания. В качестве независимой переменной использовали степень синдрома дыхательных расстройств (таблица 5).
Из приведенной таблицы 5 следует, что самую высокую информативность при определении степени тяжести СДР имели 40-минутный прирост средней активности СДГ и ГФДГ в популяции лимфоцитов и параметры, характеризующие проницаемость митохондриальной мембраны (параметры СДГ (10 мин.)). Таким образом, проведенный анализ выявил большую информативность показателей внутриклеточного метаболизма по сравнению с параметрами КЩС и показателями газообменной функции легких.
Таблица 5. Определение степени тяжести СДР (1-3) у недоношенных новорожденных по изменению ферментного статуса лимфоцитов на введение комплекса «Корилип».
Множественный коэффициент корреляции Р=0.95 п=62 Зависимая переменная — степень тяжести СДР.
где сЮДГО, аТФДГС! — изменение активности СДГ и ГФДГ через 40 минут после введения суппозитория «Корилип»
Анализ показал прогностические возможности околочасового теста дыхания для оценки продолжительности кислородотерапии при лечении недоношенных детей с СДР. По реакции ферментного статуса лимфоцитов на однократное введение комплекса «Корилип» можно с точностью более чем на 90% прогнозировать продолжительность кислородотерапии (прогностическое регрессионное уравнение представлено в таблице 6).
Таблица 6. Определение продолжительности кислородотерапии у недоношенных новорожденных с СДР по реакции ферментного статуса лимфоцитов на введение комплекса «Корилип» и ряду клинических признаков.
Множественный коэффициент корреляции Р=0.97 п=62
Зависимая переменная — продолжительность кислородотерапии (в днях) .
Таким образом, через 40 мин после введения комплекса «Корилип» у недоношенных новорожденных с СДР происходит улучшение интенсивности дыхания на различных функциональных уровнях организма, что указывает на возможность существенного повышения эффективности дыхания, не меняя режим легочной вентиляции. У большинства из них кофакторы цикла Кребса вызывали увеличение интенсивности дыхания как на клеточно-субклеточном, так и на органном уровнях. В ряде случаев происходило снижение показателей дыхания, чаще всего это снижение было направлено в сторону физиологической нормы.
Кофакторы цикла Кребса, действуя главным образом через конечное звено утилизации кислорода, повышают интенсивность дыхания в среднем на 25%. Десятидневный курс лечения комплексом «Корилип» оказался эффективным для недоношенных новорожденных с СДГ, однако у наиболее тяжелых детей для необходимо увеличить продолжительность до 15-20 дней, а для закрепления терапевтического эффекта увеличить кратность курсов до 3-6.
Значительное повышение интенсивности внешнего дыхания у больных с СДР, по-видимому, обусловлено частичным купированием «стресса» на уровне митохондрий. Одновременно происходит усиление аэробного гликолиза в клетках миокарда (увеличение объемной скорости кровотока), дыхательной мускулатуры и улучшение кислородотранспортной функции крови: снижение ацидоза, уменьшение вязкости эритроцитарной мембраны.
Избирательное действие «Корилипа» на систему дыхания и высокая информативность клеточного и субклеточного ее звена позволяет использовать потенцированный околочасовой биоритм в качестве диагностико-прогностического теста для индивидуализации лечения недоношенных новорожденных с бронхолегочной патологией. С целью выявления эффективности применения препаратов комплекса «Корилип» было обследовано также 32 новорожденных ребенка и 50 детей в возрасте от 1 месяца до года. Среди новорожденных 16 детей были здоровыми, 7 детей перенесли острую интранатальную гипоксию, 9 детей перенесли хроническую антенатальную гипоксию. Среди детей грудного возраста 10 детей были здоровыми, 40 детей с гипоксическим поражением ЦНС. Обследованные дети с гипоксическим поражением ЦНС получали комплексное лечение, включающее метаболитную терапию комплексом «Корилип». У новорожденных детей, перенесших хроническую внуьриутробную гипоксию на фоне комплексного лечения отмечалась положительная динамика в течении гипертензионного синдрома (клинические симптомы внутричерепной гипертензии за время наблюдения не нарастали, а у некоторых детей отмечалась тенденция к купированию этих симптомов), синдрома угнетения ЦНС (дети становились более активными, восстанавливался режим сна и бодрствования, отмечалась положительная динамика весовой кривой. У новорожденных, перенесших острую интранатальную гипоксию с клиникой синдрома повышенной нервно-рефлекторной возбудимости и ультразуковыми признаками формирующейся внутричерепной гипертензии в виде повышения эхоплотности отдельных структур мозга, метаболитная терапия тормозила нарастание неврологической симптоматики, а в ряде случаев способствовала купированию данных симптомов. На наш взгляд подобное воздействие метаболитной терапии препаратом «Корилип» у данного контингента новорожденных детей связано со своевременной патогенетически обоснованной коррекции энергетического метаболизма не только нервной клетки, пострадавшей в результате острого или хронического кислородного голодания, но и клеток эндотелия сосудистых сплетений мозга, что в конечном итоге приводит к восстановлению обменных процессов, связанных с продукцией внутримозговой жидкости.
Нами выявлено, что у новорожденных, перенесших острую интранальную гипоксию, наблюдается высокая активность митохондрий (по активности СДГ), а у новорожденных, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию, показатели митохондриальной активности снижены. В процессе комплексного лечения с использованием ректальных суппозиториев «Корилип» у детей, перенесших острую интранатальную гипоксию и хроническую внутриутробную гипоксию, показатели митохондриальной активности достоверно приблизились к уровню условно здоровых детей (рис. 5).
Рис. 5. Динамика цитохимических показателей у детей в процессе комплексного лечения с использованием комплекса «Корилип».
Таким образом, проведенные нами исследования показали эффективность применения препарата «Корилип» у новорожденных доношенных и недоношенных детей. Применение препарата «Корилип» показано как самостоятельное лечение, так и в комплексе с базисной терапией. У здорового ребенка метабол итная терапия должна применяться в «критические периоды» развития: в периоды становления новых функций (ребенок начинает держать головку, начинает сидеть, стоять, ходить и т.д.), перед поступлением в детское учреждение, в периоды инфекционных эпидемий, перед проведением профилактических прививок, во время заболевания и в любой другой стрессовой ситуации.
Литература :