Авторы: Руководитель лаборатории цитохимии, Доктор биологических наук Петричук С.В.; Главный научный сотрудник Доктор медицинских наук, профессор Шищенко В.М.
Цивилизованность человека предполагает бережное отношение к своим предкам и своему потомству, поскольку лишь в рамках культурной преемственности возможно поддержание и тем более развитие сложных технологий. Это подтверждается всей историей человечества. Сейчас совместными усилиями всего населения в рамках существующего экономического уклада готовится состояние здоровья человека на ближайшие годы, обозримых в прогнозах десятилетий, что может составить основу стратегического подхода к обеспечению страхования материнства и детства.
В последние годы на фоне резкого снижения рождаемости в Москве отмечается существенное нарастание частоты перинатальной патологии (в 1,5-2 раза), стабилизация частоты и рождения недоношенных детей (7-9%). Наблюдается определенный патоморфоззаболеваний периода новорожденности, патогенетически связанный с ухудшением состояния здоровья матерей: большинство заболеваний у детей характеризуется полисистемными нарушениями, нейро-соматическими расстройствами, протекающими на фоне значительно сниженной резистентности в репаративном периоде таких заболеваний, как перинатальная энцефалопатия, сепсис, пневмония, респираторный дистресс-синдром и т.д.. У большинства детей отмечаются стойкие нарушения функций различных органов исистем, развивается синдром дизадаптации (синдром повышенной возбудимости, дизбактериоз, дискенезия желудочно-кишечного тракта, аллергические реакции, затяжное и рецидивирующее течеиие ОРВИ.
У 70-95% новорожденных с клинически выраженной патологией доказано наличие врождённой энтеровирусной инфекции, что связано с вертикальной передачей вирусов, т.е. с заражением плода от матери с хронической формой соответствующей инфекции. Срывадаптации материнского организма к эндогенной вирусной инфекции при вертикальной передаче вируса является основным условием осложнённого течения беременности и относительно тяжёлого течения внутриутробной инфекции.
При моделировании хронической Коксаки вирусной инфекции и вертикальной передачи вируса на мышах была подтверждена этиологическая связь депрессии ферментов аэробного дыхания в лимфоцитах периферической крови с вирусной инфекцией. Применение соответствующего комплекса препаратов (кофакторов и субстратов цикла Кребса) у самок с хронической инфекцией сопровождалось повышением активности дегидрогеназ сукцината, альфа-глицерофосфата, глутамата в лимфоцитах периферической крови и тканях внутренних органов; одновременным достоверным снижением активности накопления вируса в организме самок и их плодов. В связи с тем, что одним из ведущих звеньев патогенеза хронической Коксаки вирусной инфекции является индуцированная вирусом гистологическая гипоксия, нами было проведено изучение противовирусной активности в эксперименте и клиническое испытание препаратов метаболического действия с разными вариантами введения (внутримышечно, в виде таблеток и порошков, в виде ректальныхсуппозиториев).
Всё вышесказанное определило одно из направлений работы лаборатории цитохимии совместно с рядом клинических отделений НИИ педиатрии НЦЗД РАМН и других медицинских учреждений г.Москвы: коррекция ферментного статуса клеток крови, отражающего функциональное состояние внутренних органов и организма в целом, кофакторами и субстратами у пациентов разного возраста.
В течение последних 18 лет в НИИ педиатрии РАМН проводятся исследования по применению кофакторов и субстратов различных метаболических циклов в лечении детей; проведены клинические испытания двух метаболических комплексов, которые былипредставлены в виде ректальных суппозиториев «Корилип».
Суппозиторий «Корилип» содержит:
Все продукты питания в организме расщепляются до ацетил-КоА (аминокислоты — до кетоглутарата, сукцината, фумарата и окса-лоацетата), который вступает в конечный путь окисления — в цикл трикарбоновых кислот. Оптимизировать деятельность ферментных систем цикла Кребса можно разными путями, в частности, введением субстратов или кофакторов.
Активация цикла ди- и трикарбоновых кислот возможна также путем регуляции двух важных этапов: 1) окисления пировиноградной кислоты до ацетил-КоА и затем взаимодействия с оксалоацетатом до образования лимонной кислоты; 2) окисления кетоглутаровой кислоты до сукцината (янтарной кислоты). Оба эти этапа катализируются полиферментными комплексами в состав которых входит липоевая кислота.
Кокарбоксилазаявляется коферментом ферментов, участвующих в процессах углеводного обмена, катализирует карбоксилирование и декарбоксилирование ос-кетокислот. Рибофлавинмоно-нуклеотид (ФМН) представляет собой готовую форму кофермента, образующуюся в организме из рибофлавина(В2) путем фосфорилирования. ФМН является предшественником одного из основных переносчиков электронов — флавинадениннуклеотида. ФМН входит в состав активного центра флавиндегидрогеназ, в частности сукцината и а-глицерофосфата.
Комплекс «Корилип» показан в случаях понижения активности флавопротеидов (в более выраженной форме — это проявление хронической тканевой гипоксии), деформации клеточного распределения в сторону преобладания клеток с низкой активностью, низким клеточным разнообразием и пр.
Суппозитории «Корилип» апробировались в клинико-диагностическом центре и лаборатории цитохимии НИИ педиатрии НЦЗД РАМН. Исследования проводились совместно с Центром акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, с Московскимпротивогерпетическим центром, с 25-м роддомом.
Состав суппозиториев разработан совместными усилиями сотрудниками лаборатории цитохимии института под руководством профессора Нарциссова Р.П. и сотрудниками НИИ фармации под руководством канд. фарм. наук Г.С.Киселёвой и Л.В. Сологуб. Состав суппозиториев был определён на основании изменений ферментативной активности в клетках периферической крови и внутренних органов.
Основная задача данного исследования — оценка эффективности применения суппозиториев «Корилип» у пациентов разного возраста была решена с использованием ряда функциональных, биохимических, цитохимических и математико-статистических методовисследования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Испытание превентивной эффективности суппозиториев проводилось у 64 женщин группы риска и у их детей, наблюдавшихся на протяжении года после рождения. Суппозитории применялись на фоне базисной терапии и у 31 женщины во время беременности подобязательным контролем цитохимического анализа (Цитохимическая экспертиза). Только базисную (общепринятую) терапию получали 33 женщины группы сравнения.
Назначение и контроль за эффективностью суппозиториев «Корилип» осуществлялся с помощью количественного цитохимического анализа. Ферментный статус лимфоцитов периферической крови исследовали в классическом варианте постановки реакции (Р.П.Нарциссов, 1969-1984), включающем определение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и глицерофосфатдегидрогеназы (ГФДГ), а также в различных модификациях классического варианта, позволяющих оценить проницаемость мембран и устойчивость локуса митохондрий, содержащего сукцинатдегидрогеназу. Проницаемость мембраны митохондрий опосредованно оценивали по активности СДГ после 10 мин. инкубации. Исходили из того, что скорость образования продукта реакции при выявлении активности СДГ максимальна в первые минуты экспозиции и минимальна при времени экспозиции 60 минут.
Этот метод позволил определять не только среднюю активность фермента, как это делается в биохимических исследованиях, но позволил рассматривать в качестве характеристик параметры распределения клеток по активности фермента — коэффициенты второго, третьего и четвертого порядка (коэффициенты вариации, асимметрии, эксцесса), а также меру клеточного разнообразия (относительную энтропию информации). Совокупность этих параметров распределения по активности фермента и составляет понятие ферментного статуса клеток крови. Не всегда реакцию клеток крови на внешние воздействия удается выявить по изменению средней активности фермента, гораздо чаще изменения затрагивают какую-то часть популяции клеток, что отражается в статистических параметрах распределения. Наиболее часто клеткой, с которой работает клинический цитохимик, является лимфоцит.
Анализ клеточной популяции позволяет выявить изменения различных клеточных субпопуляций на фоне еще не измененной средней активности. Эти изменения клеточной структуры появляются раньше клинических признаков заболевания (рис.1).
В разгар острого заболевания наблюдается, как правило, небольшая активация всей клеточной популяции лейкоцитов, которая при затяжном течении переходит в депрессию.
В периоде выздоровления или ремиссии при нормализации клинических показателей мы часто наблюдаем отклонения в ферментном статусе, что свидетельствует о неполном выздоровлении на уровне клеточной популяции.
Рис. 1. Стадии реакции клеточной популяции лимфоцитов в процессе развития заболевания.
Для оценки функциональной активности митохондрий использовали цитоморфоденситометрический метод определения активности СДГ на анализаторе изображения фирмы «Диаморф». (Р.П.Нарциссов, 1998; С.В.Петричук и соав. 2001). Анализатор изображения клетки помимо подсчета числа гранул формазана — продукта цитохимической реакции — в каждой клетке позволяет определить их геометрические и оптические параметры (рис.1). При определении активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) — фермента, локализованного на внутренней мембране митохондрий и отражающего функциональную активность митохондрий, геометрические размеры гранул (площадь, периметр) представляют собой размеры митохондрий, а оптическая плотность — интенсивность ферментной реакции. Метод позволяет оценить функциональную активность отдельно лежащих митохондрий и митохондрий, объединенных в конгломераты (кластеры).
При патологическом процессе в первую очередь изменения затрагивают отдельно лежащие митохондрии, у которых сначала изменяется их площадь, а затем оптическая плотность. Более тяжелые патологические состояния приводят к уменьшению функциональнойактивности как отдельно лежащих гранул, так и кластеров.
Анализ функциональной активности митохондрий на основецитоморфоденситометрических параметров позволяет выявить особенности течения патологического процесса на субклеточном уровне и оценить эффективность любого проводимого лечения.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Важное значение применение препаратов энергонормализирующего действия имеет у женщин, готовящихся к беременности и у беременных. Этот подход следует рассматривать как метаболическое пособие, по ассоциации с акушерским пособием.
Различные эксперименты на животных доказали положительный эффект от применения препаратов, входящих в энергонормализирующий комплекс «Корилип». Так, например, введение их на фоне физиологического течения беременности выявило не только отсутствие эмбриотоксического и тератогенного эффекта, но и их положительное действие: ни одного погибшего помета в опытной группе (против 20% в контрольной) на фоне в два раза большего количества плодов. Результаты других экспериментов свидетельствовали о защитном эффекте метаболической коррекции к действию микробного фактора, способствующим устойчивости потомства мышей при введении беременным самкам стафилококковой культуры.
Метаболическое пособие в виде комплекса «Корилип» необходимо назначать всем женщинам, особенно женщинам группы высокого риска развития перинатальной патологии у детей.
В группу риска входят женщины с отягощенным акушерским анамнезом в виде повторных выкидышей, мертворождений, бесплодия и хронических воспалительных заболеваний придатков; женщины с хроническими соматическими заболеваниями, часто болеющиеОРВИ, имеющие высокую эмоциональную и физическую нагрузку. Перечисленная патология в значительной степени определяет и исходные (до приема препаратов) цитохимические показатели. У этих женщин, как правило, наблюдается снижение активности СДГ и а-ГФДГ на фоне деформации структуры популяции в виде сниженного количества лимфоцитов с типичной активностью (эксцесс меньше -0,8), преобладанием в популяции клеток с низкой активностью (асимметрия меньше — 0,8). Женщинам группы риска показано назначение комплекса «Корилип» как в качестве самостоятельного лечения, так и в комплексе со специализированной терапией.
Выбор продолжительности курсов (10 дней) объясняется тем, что через 4-5 дней после начала приема препаратов наблюдается положительная динамика в цитохимическом статусе лейкоцитов, заключающаяся, в частности, в увеличении средней активности СДГ исс-ГФДГ и тенденции к нормализации остальных элементов структуры популяции. Количество назначаемых курсов определяется положительной динамикой цитохимических показателей и стабильностью их изменений. Как правило, необходимо не менее 6-8 курсовкомплексом «Корилип» для нормализации показателей ферментного статуса и самочувствия женщины (рис. 2)
Рис. 2. Положительная динамика активности сукцинатдегидроге-назы лимфоцитов у женщин группы риска после 6 курсов терапии комплексом «Корилип»
Для исследования степени напряжения энергетического метаболизма в ответ на введение комплекса суппозиториев «Корилип» нами использовалась модификация цитохимического анализа — проба с добавлением к основному субстрату модулятора активности СДГ — изолимонной кислоты (проба с изоцитратом, СДГ(ИЗО)) [М.Н.Кондрашова и соав., 1987, Петричук СВ. и соав., 1990]. Известно, что в ответ на действие интенсивного внешнего раздражителя происходит резкое повышение выработки энергетических ресурсов в клетках организма, идущих на обеспечение ответной реакции. Для предотвращения чрезмерного расходования субстратов энергетического цикла и истощения митохондриальной активности существует защитный механизм блокирования основного митохондриального фермента — сукцинатдегидрогеназы. Данный блок инакти-вируется при проведении реакции по выявлению активности СДГ с добавлением изолимонной кислоты к основному субстрату.
Повышение активности фермента в пробе с изолимонной кислотой, по сравнению с пробой на основном субстрате свидетельствует о напряжении энергетического метаболизма.
Для оценки степени напряжения энергетического метаболизма вычисляется коэффициент К:
К=СДГ(ИЗО)/СДГ=1,15 или 115%
Значение коэффициента «К»>1 является неблагоприятным цитохимическим признаком, свидетельствует о напряжении клеточного метаболизма и о нестабильности митохондриальной мембраны. У условно здоровых пациентов значение коэффициента «К» составляет 80 — 90 %.
В процессе лечения суппозиториями «Корилип» значение коэффициента «К» уменьшается и приближается к нормальным значениям.
Таблица 1.
Изменения цитохимических параметров у женщин группы риска, получавших «Корилип» (п=26)
* Изменения достоверны, РО.05
Эффективность метаболической коррекции можно оценить с двух сторон. Во-первых, сравнением течения и исхода беременности в двух группах женщин — получавших и не получавших метаболическое пособие. Во-вторых, оценкой исхода беременности и развитием детей на первом году жизни в зависимости от сроков, в которые была начата метаболическая коррекция женщинам группы риска.
Выявлено, что у беременных женщин группы риска (п=31), получавших курсовое лечение комплексом «Корилип» на фоне базисной терапии, частота осложнений беременности повторными ОРВИ во 2 и 3 триместрах была в 2,5 раза ниже по сравнению с неполучавшими (п=33). У них реже отмечались обострения хронических очагов инфекции. Гипохромная анемия у беременных, получавших метаболическую коррекцию, диагностирована в 2,9 раза реже, чем в группе сравнения.
Клинические признаки морфо-функциональной незрелости среди доношенных детей (выраженное лануго, гипорефлексия, слабый крик, пастозность и отечность подкожно-жировой клетчатки, податливость костей черепа, увеличенные размеры большого родничка) наблюдались у 23,1% детей, получавших комплекс «Корилип», и 42,5% детей — не получавших ее. В свою очередь, среди женшин, которым проведено не менее 6-8 курсов, клинические признаки морфофункциональной незрелости отмечались почти в 2 раза реже по сравнению с получившими ее 1 -3 раза.
У женщин, получавших метаболическое пособие за 3-9 месяцев до беременности, наблюдалась стабилизация месячного цикла с наличием четко выраженной двухфазности, меньшей болезненности менструации. Все женщины родили живых доношенных детей (на 39-40-ой неделе) с весом 2800,0-3900,0, оценкой по шкале Апгар 8-9 баллов, неонатальныйпериод у них протекал без осложнений. На первом году дети практически не болели. К 1 году нервно-психическое развитие у них было нормальным и соответствовало 28-30 баллам по таблице Л.Т.Журба.
Основные рекомендации по применению препаратного комплекса «Корилип» у женщин состоят в следующем:
наиболее эффективное по отношению к ребенку применениепрепаратов-метаболитов наблюдается у женщин, получающих терапию за 6-9 месяцев до и в течение беременности под контролем цитохимического анализа. Раннее применение препарата обеспечивает более высокий уровень энергетики тканей и клеток беременной женщины (плаценты, тканей плода), новорожденных и грудных детей, сведение к минимуму перинатальных осложнений, лучшему развитию детей на первом году
жизни.
продолжительность курсов терапии комплексом «Корилип» (10дней) и их кратность определяется показателями активности ферментов лейкоцитов периферической крови.
в течение беременности необходимо назначение метаболического пособия в критические периоды (по цитохимическием показателям): 5-8 недель, 10-12 недель, 20 неделя, 27-28 недель, 30-32 неделя, 35-37 недель.
Подготовка супружеской пары к беременности должна начинаться не менее чем за 6-9 месяцев до беременности, в оптимальном варианте год жизни родителей до зачатья должен быть отнесен к онтогенезу ребенка.
Литература :